مطالب این صفحه صرفاَ به منظور اطلاع رسانی نظری است. بدون آموزش دیدن تحت نظر متخصصین اقدام به استفاده عملی از محتوای این صفحه نکنید. بدون آموزش دیدن تحت نظر متخصصین، از فرمالین استفاده نکنید! فرمالین ماده ای کشنده و سرطانزا است!

تثبیت

تثبیت یا فیکساسیون را میتوان اولین مرحله از مراحل تهیۀ نمونۀ بافت شناسی و آسیب شناسی دانست.

بافت حیوانی بلافاصله پس از جدا شدن از بدن موجود زنده، از اکسیژن و مواد غذایی محروم میشود. جدا شدن از منابع غذایی و اکسیژن، سلولهای بافت را به سوی مرگ هدایت میکند. مرگ سلولی تمامیت سلول را تهدید میکند و سلول در معرض انواع عوارضی قرار میگیرد که شکل ظاهری آن را تغییر میدهد.و این دقیقاً همان چیزی است که “فن بافت‌شناسی” با آن مبارزه میکند. چنانکه جای دیگر ذکر کرده ایم، مهمترین، و گاهی تنها هدف از تکنیک بافت‌شناسی حفظ شکل بافت در حالتی است که در زمان حیات داشته است.

پس از مرگ سلول اولین عاملی که به بافت حمله میکند و شکل آن را تغییر میدهد، آنزیمهای داخلیِ خودِ سلول است. تقریباً در همۀ سلولها، آنزیمهایی وجود دارند که درون نافه های محصور با غشاء حبس شده اند و در هنگام حیات این آنزیمها، تحت مدیریت سلول و به نحوی کنترل شده، به درون یا بیرون سلول آزاد میشوند و وظائف خود را انجام میدهند. اما پس از مرگ، غشاء هایی که این آنزیمها را محبوس کرده اند، تمامیّت خود را از دست میدهند و آنزیمها به نحو افسار گسیخته وارد سیتوپلاسم میشوند و به هضم مواد داخل سیتوپلاسم میپردازند، و اندامکهای داخل سلول را از بین میبرند و شکل اولیۀ سلول و بافت را به هم میریزند. به این واکنش که توسط آنزیمهای خودِ سلولها ایجاد میشود، اتولیز میگویند.

اولین وظیفۀ ماده ای که برای تثبیت بافت استفاده میشود، جلوگیری از عمل این آنزیمهاست.

عامل دیگری که پس از جدا کردن بافت از بدن موجود زنده و مرگ سلولها موجب به هم ریختن شکل بافت میشود، باکتری ها هستند. باکتریهای محیط همیشه مترصد حمله به بافت موجود زنده هستند که سرشار از مواد غذایی و محیطی مناسب برای رشد و تکثیر باکتریها است. سلول تا وقتی زنده است، در پناه دستگاه ایمنی بدن از آسیب باکتریها و میکروارگانیسمها در امان است اما به محض جدا شدن از بدن موجود زنده در معرض حملۀ باکتریها قرار میگیرد. به این ترتیب دومین خاصیت مادۀ تثبیت کننده، باکتری کُش بودن آن است.

بافت، در طول مسیر خود از مرحلۀ بافت برداری تا آخرین مرحله که خشکیدن باشد، در معرض محلولهای متعددی مانند آب، الکل و گزیلل و غیر آنها قرار دارد. این محلولها، میتوانند ملکولهای بافت را در خود حل کنند. عمدۀ ملکولهای شیمیایی تشکیل دهندۀ سلول که اسیدهای آمینه و قندها باشند، در آب محلول هستند. چربیها نیز در گزیلل و الکل حل میشوند. حل شدنِ این مواد به معنی از دست رفتنِ محتوای سلولها و بافت است. بنا بر این مادۀ تثبیت کننده باید به نحوی از حل شدن عمدۀ مواد بافت جلوگیری کند.

پر مصرف ترین تثبیت کننده ای که در فن بافت‌شناسی مورد استفاده قرار میگیرد، محلول فرمالدئید در آب است.

این محلول که به “فرمالین” مشهور است، همۀ خواص سه گانۀ فوق را دارد. فرمالدئید، قدرت پیوند شیمیایی به برخی از مواضع ملکولهای اسیدآمینه ها دارد. این ملکول میتواند از دو سوی خود به اسیدهای آمینه بچسبد و هر ملکول فرمالدئید به دو اسید آمینه که میتواند از دو پروتئین متفاوت باشد میچسبد. به این ملکولهای فرمالدئید، بین اجزاء پروتئینهای موجود در بافت، “بَست” هایی ایجاد میکند و همۀ نقاط همۀ پروتئنهای بافت را به هم میچسباند. این واکنش شیمیایی موجب میشود که همۀ پروتئینهای یک بافت، به صورت یک پلیمر بسیار بزرگ در آید که به وسیلۀ حلقه های از جنس فرمالدئید (که البته پس از ترکیب به صورت ملکول متیلن در آمده اند) به هم زنجیر شده اند. این پلیمر بسیار بزرگ نه در آب محلول است و نه در الکل. به این نحو، اگر بافت را بلافاصله پس از جدا کردن از بدن حیوان در محلول فرمالین قرار دهیم، فرمالین به محض نفوذ به هر نقطه از بافت، پروتئینهای آن را به هم زنجیر میکند و شکل کلی و ساختمان طبیعی آن را تا آخرین مراحل تهیۀ بافت، محفوظ نگاه میدارد.

تصویر: چگونگی واکنش ملکول فرمالدئید با پروتئین و تثبیت آن.

فرمالدئید به سبَبِ داشتنِ همین خاصیت موجب میشود که هر موجود زنده ای را در معرض مرگ قرار دهد. نفوذ فرمالدئید به یک بافت زنده، پروتئینهای آن را به هم میچسباند و آنها را از انجام عملیات حیاتی باز میدارد. به همین دلیل فرمالین یک مادۀ میکروب کش و ضد عفونی کننده، و البته خطرناک تلقی میشود. تماس گاز فرمالدئید با مخاطهای زنده نیز موجب مرگ سلولهای آنها میشود. به همین دلیل است که هنگام کار با فرمالین باید از ماسک و دستکش و در محیطی با تهویۀ مناسب استفاده کرد. فرمالین کشندۀ سلولِ زنده و سرطانزا است!

تصویر: ظرف مناسب برای نگهداری بافت در فرمالین باید نسبت به فرمالین هیچ واکنش شیمیایی نداشته باشد، باید درپوشی محکم داشته باشد و باید حجم کافی برای نگهداری بافت و دو برابر حجم بافت برای فرمالین نیز داشته باشد.

به همین ترتیب آنزیمهای داخل سلول نیز که خود، پروتئین هستند از عمل بازداشته میشوند. پس فرمالین، همۀ سه خاصیت مورد نیاز برای یک تثبیت کننده یا فیکساتیو را با داشتن میل ترکیبی با اسیدهای آمینه داراست.

علاوه بر این، سرعت نفوذ فرمالین به بافت نیز زیاد است و به همین سبب به فوریت به همۀ سلولهای بافتی که در این محلول غوطه ور شده نفوذ میکند و واکنش لازم برای تثبیت آن را انجام میدهد.

خاصیت بسیار مهم دیگری که فرمالین را نسبت به دیگر تثبیت کننده ها، ممتاز میکند، این است که حجم بافت پس از تثبیت شدن در فرمالین تغییر اندکی میکند. در حالی که بسیاری دیگر از فیکساتیوها حجم بافت را کاهش میدهند و به اصطلاح، بافت را دچار انکماش میکنند. مثلا اتانول که خود، یک تثبیت کننده یا فیکساتیو است موجب انکماش زیاد در بافت میشود. تغییر نکردن حجم بافت، که به معنی تغییر نیافتن شکل بافت از حالت زنده است، امتیاز مهمی تلقی میشود و خصوصاً در تحقیقات کمّی اهمیت بیشتری دارد.

فرمالدئید یک گاز است که در آب قابل انحلال است و آب در غلظت حدود 37 درصد با فرمالدئید به اشباع میرسد و پس از آن دیگر فرمالدئید در آب بیش از این حل نمیشود. محلول اشباع شدۀ فرمالدئید، در شرایطی مانند عوض شدن درجۀ حرارت و مثل آن، قدرت حلالیت خود را تا حدی از دست میدهد و در این حالت فرمالدئیدِ موجود در آن، به صورت رسوبِ پارافرمالدئید، از آن جدا میشود.

مدت زمانی که بافت میباید در فرمالین بماند بسته به نوع، اندازه و ابعاد بافت متفاوت است. برخی منابع اصرار دارند که حجم فرمالین باید دستِ کم چهار برابر حجم بافت باشد اما مشاهدات برخی محققین این مقدار را تنها دو برابر میدانند. برای یکی از این مطالعات مراجعه کنید به:

Buesa, René J., and Maxim V. Peshkov. “How much formalin is enough to fix tissues?.” Annals of diagnostic pathology 16.3 (2012): 202-209.

غلظت مورد استفاده و معمول در بافت‌شناسی و آسیب شناسی، 10 درصد است یعنی، محلول 10 درصد محلولِ اشباع شدۀ فرمالدئید در آب. توجه کنید که محلول 10 درصد فرمالین، مساوی با محلول 3.7 درصد فرمالدئید در آب است. توجه نداشتن به این اصطلاح بسیاری از دانشجویان را به اشتباه میاندازد. برای ساختن محلول 10 درصد فرمالین باید 100 سی‌سی محلول اشباع از فرمالین را با 900 سی‌سی آب مخلوط کرد. برای جلوگیری از اسیدی شدن با قلیایی شدن محلول نیز میباید با دقت از محلول بافر فسفات به جای آب استفاده کرد تا از بروز کژنما های مختلف در باف جلوگیری شود. به این ترتیب محلول تثبیت کنندۀ ایده آل فرمالین با مخلوط کردن مواد زیر به اندازۀ یاد شده به دست میاید:

محلول فرمالین اشباع (37 تا 40 درصد) 100 سی‌سی

آب مقطر 900 سی‌سی

فسفات سدیم مونوبازیک (NaH2PO4 )

4 گرم در لیتر

فسفات سدیم دی بازیک بدون آب (Na2HPO4 )

6.5 گرم در لیتر

پ.هاش محلول باید بین 6.7 تا 7.7 باشد و با زیاد و کم کردن اسید و باز باید این پ.هاش. به دست بیاید.

فرمالدئید، به همراه گلوتارالدئید، از تثبیت کننده های آلدئیدی هستند. فیکساتیوهای دیگری نیز وجود دارند که هر کدام در جای خود به طور اختصاصی مورد استفاده قرار میگیرند.

دو روش مشهور برای تثبیت

معمول ترین روش برای تثبیت بافت این است که بافت را از بدن موجود زنده جدا میکنند و آن را درون مایعِ تثبیت قرار میدهند. به این روش “غوطه” یا ایمرسیون، میگویند. روش غوطه در برخی از حوزه های مربوط به بافت‌شناسی مانند آسیب‌شناسی انسانی، ناگزیر است. اما در موارد دیگر ممکن است بتوان از تزریق یا “پرفوزیون” استفاده کرد. در این روش، مایع تثبیت، از طریق قلب در حالی که هنوز زنده است و در حال ضربان است، به همۀ بدن منتشر میشود و مایع تثبیت به هر جا که مویرگی وجود داشته باشد، نفوذ میکند. پرفوزیون روش بسیار مؤثری در تثبیت بافتهای حیوان آزمایشگاهی است، اما آسانترین روش نیست. گاهی، فقط قطعۀ کوچکی از یک بافت مورد نظر است، در این صورت نیز تثبیت همۀ حیوان به وسیلۀ پرفوزیون، معقول و به صرفه نیست. به همین سَبَب است که هنوز روش غوطه پیشتاز باقی مانده است.

در این شیوه، حیوان پس از بیهوشی عمیق، به وسیلۀ بیهوش کنندۀ استنشاقی، یا تزریقی؛ باز میشود و بافت مورد نظر برداشت میشود. در هنگام بیهوش کردن، گاهی مادۀ دیگری که فقط نقش سست کنندۀ عضلات را دارند نیز به حیوان تزریق میشود. اگر برای بیهوش کردن حیوان از اتر استفاده شود نیازی به شُل کنندۀ عضلانی نداریم چرا که این گاز، علاوه بر بیهوش کنندگی، شُل کنندۀ عضلات نیز هست.
بافت‌شناس های متبحر به ندرت برای تشریح حیوان، از تیغ استفاده میکنند. برای جدا سازی بافت از قیچی های ظریف و یک سر گرد و اَنبُرَک های سَرگِرد، استفاده میکنند. به کالبد شناسی حیوان مورد مطالعه تسلط دارند. تا وقتی که لازم نباشد، هیچ رگی بزرگی را قطع نمیکنند تا خونریزی ایجاد نشود وکارشان را سریع و پیش از مرگ حیوان تمام میکنند. استفاده از اَنبُرَک و قیچی سَرتیز احتمال فشار و آسیب به بافت را زیاد میکند.

مطالب این صفحه صرفاَ به منظور اطلاع رسانی نظری است. بدون آموزش دیدن تحت نظر متخصصین اقدام به استفاده عملی از محتوای این صفحه نکنید. بدون آموزش دیدن تحت نظر متخصصین، از فرمالین استفاده نکنید! فرمالین ماده ای کشنده و سرطانزا است!

برای آگاهی تفصیلی از واکنش شیمیایی فرمالدئید با پروتئین طی روند تثبیت به این مقاله مراجعه کنید:

Thavarajah, Rooban, et al. “Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.” Journal of oral and maxillofacial pathology: JOMFP16.3 (2012): 400.

 

لغتنامه

تثبیت Fixation
نافه Vesicule
اتولیز Autolysis
فرمالین Formalin
فرمالدئید Formaldehyde
انکماش Shrinkage
فسفات سدیم مونوبازیک sodium phosphate monobasic
فسفات سدیم دی بازیک بدون آب Sodium phosphate dibasic (anhydrous)
گلوتارالدئید Glutaraldehyde

 

 

 


پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.